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授权级别：独家授权与委托
作品类别：国际论文网-医药哲学论文
会员：suyu
阅读： 次
编辑评分： 3
投稿时间：2018/11/14 11:51:10
最新修改：2018/11/14 11:51:10
来源：小品剧本网www.xiaopinjuben.com/ |
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| 论文名：《冬凌草抗菌活性成分讨论》 |
| 【原创剧本网】作者:网载 |
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冬凌草抗菌活性成分讨论
冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosiarubescens (Hemsl.) Hara 的干燥地上部分，产于湖北、四川、贵州、广西、河南和河北等地。2010 年版《中国药典》记载，其味苦、甘，性微寒，具有清热解毒、活血止痛之功效，用于治疗咽喉肿痛、癥瘕痞块、蛇虫咬伤。现代研究表明，冬凌草中含有萜类(二萜和三萜)、黄酮、生物碱、挥发油和有机酸等化学成分，具有抗肿瘤、抗突变、抗菌消炎、抗氧化和降压等作用，但是目前有些作用机制仍不清楚，有待进一步研究。
国内外主要报道了冬凌草提取物的抗菌作用，冬凌草中化合物抑制金黄色葡萄球菌已有报道，但是未见对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)和β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌(Beta lactamase positiveStaphylococcus aureus, ESBLs-SA) 的抑制作用报道。本课题组采用活性追踪的方法，对抗菌活性较强的乙酸乙酯部位进行活性成分分离，利用纸片扩散法(K-B 法)筛选抗菌活性成分，为开发冬凌草作为植物源抗菌剂提供了实验支持。
1 材料
供试菌种金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌(ESBLs-SA)由河南大学淮河医院临床分离得到，经全自动微生物分析仪VITEK-AMS 鉴定，符合率达99%。培养基Nutrient Agar 由北京奥博星生物技术有限公司提供;Broth Medium 由北京奥博星生物技术有限公司提供;其他试剂均为分析纯。LRH-150 生化培养箱(上海一恒科技有限公司)，LDZX-30KB 立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，JJ-CJ-2FD 洁净工作台(吴江市净化设备总厂)，ZWX-201A 紫外线空气消毒器，电子天平(Mettler-Toledo)，打孔器。Bruker Avance-400M 核磁共振谱仪，LC3000 型高效液相色谱仪，Agilent 6890 -5975 GC-MS 联用仪，柱色谱为青岛海洋化工生产的填料为硅胶200~300 目及硅胶H，薄层色谱为青岛海洋化工生产的GF254 硅胶板，Sephadex LH-20 由瑞典Pharmacia公司生产。冬凌草于2012 年9 月采自河南省济源地区，由河南大学中药研究所李昌勤副教授鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosia rubescens (Hemsl.)Hara 的干燥地上部分，标本存于黄河科技学院天然药物研究所。
2 方法
2.1 提取分离
将叶粉碎，室温下70%乙醇浸提2 次，每次3天，合并，减压回收溶剂，得总浸膏。将总浸膏用200~300 目硅胶拌样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位。
K-B 法发现乙酸乙酯部位和甲醇部位具有抗菌活性。采用活性追踪的方法，对抗菌活性较强的乙酸乙酯部位进行硅胶(200~300 目)柱色谱，用氯仿-甲醇(100∶1~8∶2)梯度洗脱，用TLC 检测，合并相同的部分，得6 个组分。各组分反复硅胶H 柱色谱、LC3000 型高效液相柱色谱、Sephadex LH-20 柱色谱和重结晶等分离得到化合物1 (30 mg)、2(8.5mg)、3(4.6 mg)、4(3.0 mg)、5(10.5)和6(4.3 mg)。
2.2 抗菌活性
按照参考文献[8~10]方法，采用K-B 法进行体外抑菌活性研究。在无菌操作台上将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿，放凉后加入已配好的菌液0.1mL，用涂布器将菌液涂布均匀，用微量加样器分别取5 μL 样品加到圆形滤(直径6 mm)上，等距置于含菌平板上，同时用DMSO 作空白对照，小檗碱为阳性对照，37℃恒温培养24 h，观察菌落生长情况，精确测定抑菌圈直径。每个样品平行操作3 份，结果取平均值。将出现抑菌圈的样品浓度进行对半稀释，按同样操作进行，出现抑菌圈的最低样品浓度即为此样品的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。
3 结果
3.1 结构鉴定
化合物1：无色针状晶体，mp 245.5℃~248℃。ESI-MS m/z：363 [M-H] -。1H-NMR(CD3COCD3，400MHz)δ：6.16，5.56(各1H，s ，H-17)，5.06(1H，s，H-14)，4.36，4.11 (各1H，d，J =10.0 Hz，H -20)，3.78(1H，d，J =7.0 Hz，H-6)，3.65 (1H，dd，J =11.6 Hz，H -1)，1.21，1.16 ( 各3H，s ，C4 -Me2)。13C -NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ：211(C-15)，153.6(C-16)，119.5(C -17)，98.01(C -7)，74.8(C -6)，74.3(C -14)，73.7(C-1)，64.3(C-20)，63.3(C-8)，61.1(C-5)，55.3(C-9)，44.6(C-13)，42.5(C-10)，40.2(C-3)，34.5(C-4)，33.7(C-18)，31.3(C-12)，30.5(C-2)，22.8(C-19)，20.5(C-11)。以上波谱数据与文献一致，确定该化合物为冬凌草甲素。
化合物2：浅黄色粉末，mp196℃~198.5℃。ESIMSm/z：359[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ：7.04(1H，s，H-2′)，6.75(1H，d，J=7.5 Hz，H-5′)，6.99 (1H，d，J =8.0 Hz，H-6′)，7.44 (1H，d，J =16.0Hz，H -7′)，6.24 (1H，d，J =16.0 Hz，H -8′)，6.51(1H，d，J =7.5 Hz，H-6)，6.68 (1H，brs，H-2)，6.63(1H，d，J =8.0 Hz，H -5)，2.76 (1H，t，J=14.0，10.0Hz，H-7a)，3.01 (1H，m，H-7b)，4.85(1H，d，J =7.5Hz，H-8)。13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δ：126.1(C-1)，115.3 (C-2)，144.4 (C-3)，145.5 (C-4)，116.2(C-5)，120.3(C-6)，36.8(C-7)，74.5(C-8)，172.4(C-9)，129.3(C-1′)，114.2(C-2′)，145.6(C-3′)，146.5(C-4′)，116.5(C-5′)，121.5(C-6′)，149.4(C-7′)，117.3(C-8′)，166.4(C-9′)。以上波谱数据与文献[12]对一致，确定该化合物为迷迭香酸。
化合物3：黄白色结晶，mp 223.5℃~226℃。EIMSm/z：180[M+]。1H-NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ：7.32(1H，d，J =16 Hz，H-7)，7.13(1H，d，J =1.6 Hz，H-2)，7.07(1H，dd，J =1.6, 8.0 Hz，H-6)，6.25(1H，d，J =16 Hz，H-8)。13C-NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ：127.4(C-1)，115.7(C-2)，146.3(C-3)，148.2(C-4)，116.4(C -5)，122.2(C -6)，145.5(C -7)，115.2(C-8)，167.8(C-9)。以上波谱数据与文献一致，确定该化合物为咖啡酸。
化合物4：白色结晶，mp 156℃~158℃。EI-MSm/z(%)：138(M+，60)，120(M+-H2O，100)，92(120-CO，85)，64(30)，53(15)。以上波谱数据与文献一致，确定该化合物为水杨酸。
化合物5：白色结晶，mp 171℃~173℃。EI-MSm/z：194[M+]。1H-NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ：7.29(1H，d，J =1.7 Hz，H-2)，6.80 (1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，7.13 (1H，dd，J= 8.3，1.6 Hz，H-6)，7.62 (1H，d，J=15.8 Hz，H-7)，6.35(1H，d，J=15.8 Hz，H-8)，3.90(3H，s，H -OCH3)。13C -NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ：127.4(C-1)，116.2(C-2)，150.3(C -3)，148.7 (C -4)，116.2(C -5)，123.5(C -6)，146.4(C -7)，111.6(C-8)，169.2(C-9)。以上波谱数据与文献一致，确定该化合物为阿魏酸。
化合物6：黄白色结晶粉末，mp 210℃~211.5℃。EI-MS m/z：168[M+]。1H-NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ：3.87(1H，s ，4 -OCH3)，6.89(1H，d，J =8.0 Hz，H -3)，7.56 (1H，d，J =8.0 Hz，H-4)，7.55 (2H，m，H-2，6)。13C-NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ：168.7(COOH)，123.6(C -1)，113.4(C -2)，151.6(C -3)，148.1(C -4)，115.4(C-5)，124.8(C-6)，56.4(4-OCH3)。以上波谱数据与文献一致，确定该化合物为香草酸。
3.2 抗菌活性
本文利用K-B 法对冬凌草体外抗菌活性成分进行研究，各化合物对受试菌种的抑菌圈和MIC 值。在初筛浓度为10 mg·L-1 时， 冬凌草甲素对SA、MRSA 和ESBLs-SA 均有一定的抗菌活性，仅对ESBLs-SA 的活性有显著性差异(P<0.001);阿魏酸对SA 和MRSA 有显著的抗菌活性(P<0.001);水杨酸仅对SA 有明显的抗菌活性(P<0.001);迷迭香酸、咖啡酸和香草酸对SA、MRSA 和ESBLs-SA 均无抗菌活性。其中冬凌草甲素对SA、MRSA 和ESBLs-SA 的MIC 值分别为3.1、6.3、6.3 μg·disc-1，阿魏酸对SA 和MRSA 的MIC 值均为50.0 μg·disc-1，水杨酸对SA 的MIC 值为50.0 μg·disc-1。冬凌草甲素的抗菌活性最强，但仍弱于阳性对照小檗碱(MIC值均为0.16 μg·disc-1)。
4 讨论
目前，国内外对冬凌草抗菌活性的研究主要集中在提取物，对抗菌活性成分的研究较少，主要研究了冬凌草甲素对伤寒杆菌、肺炎链球菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌及甲、乙型溶血性链球菌等有抑制作用，冬凌草乙素对伤寒杆菌、白色葡萄球菌和变形杆菌等有抑制作用。本文利用K-B 法对冬凌草体外抗菌活性成分进行研究，结果显示，冬凌草甲素对SA、MRSA、ESBLs-SA 均有一定的抗菌活性，阿魏酸对SA 和MRSA 有一定的抗菌活性，水杨酸仅对SA 有抗菌活性，其中冬凌草甲素的抗菌活性最强，但仍弱于阳性对照小檗碱。
另有文献报道，迷迭香酸可以明显抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、立枯丝合菌、藤黄细球菌和大肠杆菌;咖啡酸能抑制金黄色葡萄球菌;阿魏酸能抑制肺炎杆菌、大肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、绿脓杆菌、肠杆菌和柠檬酸杆菌等致病性细菌;香草酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均有一定的抑制作用。可见，首次发现了冬凌草甲素对MRSA和ESBLs-SA 均有一定的抗菌活性，阿魏酸对MRSA有一定的抗菌活性。
本文对从冬凌草中分离出的迷迭香酸、咖啡酸和香草酸进行抗菌活性研究，结果表明迷迭香酸、咖啡酸和香草酸对SA、MRSA 和ESBLs-SA 均无抗菌活性，这与文献报道的不一致，这可能与样品的浓度、实验方法和菌株不同等有关。
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